Пасиҳамоии геномии аксари вирусҳо маълуманд.Зондҳои кислотаи нуклеинӣ, ки сегментҳои кӯтоҳи ДНК мебошанд, ки барои гибридизатсия бо ДНК-и вирусӣ ё сегментҳои РНК тарҳрезӣ шудаанд.Реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) як усули самараноктар барои муайян кардани вирус мебошад.Дар вактхои охир усулхои баланди диагностикй кор карда баромада шуданд.
A. Техникаи гибридизатсияи кислотаи нуклеинӣ
Гибридизатсияи кислотаи нуклеинӣ, асосан аз ҷумла blotting ҷанубӣ (Ҷанубӣ) ва blotting шимолӣ (Шимолӣ), як усули нави босуръат рушдёбанда дар соҳаи ташхиси вирус мебошад.Асоси таҳлили гибридизатсия ин истифодаи сегментҳои кӯтоҳи ДНК (бо номи "зонд") мебошад, ки барои гибридизатсия бо ДНК-и вирусӣ ё сегментҳои РНК тарҳрезӣ шудааст.Бо гармкунӣ ё коркарди сілтӣ, ДНК ё РНК-и ҳадафи дуқабата ба риштаҳои ягона ҷудо карда мешаванд ва сипас дар як такягоҳи сахт ҳаракат намекунанд.Пас аз он, зонд бо ДНК ё РНК ҳадаф илова карда мешавад ва гибрид карда мешавад.Азбаски зонд бо изотоп ё нуклиди ғайрирадиоактивӣ нишон дода шудааст, ДНК ё РНК-и мақсаднокро тавассути авторадиография ё системаи биотин-авидин муайян кардан мумкин аст.Азбаски аксари геномҳои вирусӣ клон карда шудаанд ва пайдарпай шудаанд, онҳоро метавон бо истифода аз пайдарпаии вируси мушаххас ҳамчун зонд дар намуна муайян кард.Дар айни замон, усулҳои гибридизатсия иборатанд аз: нуқтаҳо, гибридизатсияи in situ дар ҳуҷайраҳо, blotting DNA (DNA) (Blot Southern) ва Blotting RNA (RNA) (Worthern Blot).
Технологияи B.PCR
Дар солҳои охир, як қатор усулҳои тақвияти кислотаи нуклеинӣ дар vitro дар асоси PCR барои санҷиши вирусҳои ҳассос ё парваришнашаванда таҳия карда шуданд.PCR як усулест, ки метавонад пайдарпаии мушаххаси ДНК-ро тавассути реаксияи полимераз дар vitro синтез кунад.Раванди ПТР як давраи гармии се марҳиларо дар бар мегирад: денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ Дар ҳарорати баланд (93℃~95℃), ДНК-и дуқабата ба ду риштаи ягонаи ДНК ҷудо мешавад;пас дар ҳарорати паст (37℃~60℃), ду праймери синтезшудаи нуклеотид ба сегментҳои комплементарии ДНК пайваст мешаванд;дар ҳоле ки дар ҳарорати мувофиқ барои ферментҳои Taq (72℃), синтези занҷирҳои нави ДНК аз ибтидои 3'-охири бо истифода аз ДНК-и комплементарӣ ҳамчун қолаб ва нуклеотидҳои ягона ҳамчун мавод оғоз меёбад.Пас, пас аз ҳар як давра, як занҷири ДНК метавонад ба ду занҷир тақвият дода шавад.Такрор кардани ин раванд, ҳар як занҷири ДНК, ки дар як давра синтез карда мешавад, метавонад дар давраи навбатӣ ҳамчун шаблон истифода шавад ва шумораи занҷирҳои ДНК дар ҳар як давра дучанд мешавад, яъне истеҳсоли PCR бо суръати 2n лог зиёд мешавад.Пас аз 25 то 30 давра, истеҳсоли PCR тавассути электрофорез муайян карда мешавад ва маҳсулоти мушаххаси ДНК-ро дар зери нури ултрабунафш (254 нм) мушоҳида кардан мумкин аст.Барои бартарии хосият, ҳассосият ва роҳати худ, PCR дар ташхиси клиникии бисёр сироятҳои вирусӣ, аз қабили HCV, HIV, CMV ва HPV қабул карда шудааст.Азбаски PCR хеле ҳассос аст, он метавонад ДНК-и вирусро дар сатҳи fg муайян кунад, амалиёт бояд хеле бодиққат анҷом дода шавад, то мусбати бардурӯғ пешгирӣ карда шавад.Илова бар ин, натиҷаи мусбӣ дар санҷиши кислотаи нуклеин маънои онро надорад, ки дар намуна вируси сироятии зинда вуҷуд дорад.
Бо истифодаи васеи техникаи PCR, усулҳо ва усулҳои нав дар асоси техникаи PCR барои мақсадҳои гуногуни санҷиш таҳия карда мешаванд.Масалан, PCR-и миқдории вақти воқеӣ метавонад сарбории вирусиро муайян кунад;PCR in situ барои муайян кардани сирояти вирус дар бофта ё ҳуҷайраҳо истифода мешавад;ПЗР-и лона гузошташуда метавонад хусусияти PCR-ро зиёд кунад.Дар байни онҳо, PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ зудтар таҳия шудааст.Бисёре аз усулҳои нав, аз қабили зондҳои гидролизии TaqMan, зондҳои гибридизатсия ва зондҳои маяки молекулавӣ ба техникаи миқдории PCR дар вақти воқеӣ муттаҳид карда шудаанд, ки дар тадқиқоти клиникӣ васеъ истифода мешаванд.Ба ғайр аз дақиқ муайян кардани сарбории вирусӣ дар моеъи бадани беморон, ин усулро инчунин барои ошкор кардани мутант ба маводи мухаддир таҳаммулпазир истифода бурдан мумкин аст.Аз ин рӯ, PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ асосан дар арзёбии таъсири табобатӣ ва назорати таҳаммулпазирии маводи мухаддир истифода мешавад.
C. Муайян кардани қобилияти баланди кислотаҳои нуклеинҳои вирусӣ
Барои қонеъ кардани эҳтиёҷоти ташхиси фаврии бемориҳои нави сироятӣ, усулҳои гуногуни ошкоркунии баландсифат, ба монанди чипҳои ДНК (ДНК) таъсис дода шудаанд.Барои микросхемаҳои ДНК, зондҳои мушаххас синтез карда мешаванд ва ба микросхемаҳои хурди кремний бо зичии хеле баланд пайваст карда мешаванд, то микроаррейи зондҳои ДНК (ДНК) -ро ташкил кунанд, ки онҳоро бо намуна гибридизатсия кардан мумкин аст.Сигнали гибридизатсияро тавассути микроскопи конфокалӣ ё сканери лазерӣ тасвир кардан мумкин аст ва минбаъд тавассути компютер коркард карда мешавад ва маҷмӯи маълумоти азимро дар бораи генҳои гуногун ба даст овардан мумкин аст.Ду намуди чипи ДНК вуҷуд дорад."Чипи синтез" чунин аст: олигонуклеотидҳои мушаххас мустақиман дар чипҳо синтез карда мешаванд.Дигар чипи ҳавзи ДНК мебошад.Генҳои клоншуда ё маҳсулоти PCR дар слайд бо тартиб чоп карда мешаванд.Бартарии технологияи чипи ДНК дар як вақт ошкор кардани миқдори зиёди пайдарпаии ДНК мебошад.Варианти охирини чипи ошкоркунии патоген метавонад дар як вақт зиёда аз 1700 вируси инсонро муайян кунад.Технологияи чипи ДНК мушкилоти усулҳои анъанавии гибридизатсияи кислотаи нуклеиниро ҳал кард ва дар ташхиси вирусӣ ва омӯзиши эпидемиологӣ барномаҳои хеле васеъ дорад.
Вақти фиристодан: 23 декабри 2020